人乳寡糖（human milk oligosaccharides，HMO）是母乳中非常独特的一类寡糖，大多由3～6 个糖基组成，迄今已发现200多种；HMO是母乳中含量第3的固形物（仅次于乳糖和脂肪），初乳中HMO含量为20～25 g/L，成熟母乳中含量为10～15 g/L[1-4]。HMO的类型主要包括岩藻糖基化的中性HMO（占比35%～50%）、唾液酸化的酸性HMO（占比12%～14%）及非岩藻糖基化的中性HMO（占比42%～55%），超过70%的HMO由岩藻糖进行修饰；具有代表性的HMO包括2'-岩藻糖基乳糖（2'-fucosyllactose，2'-FL）、6'-唾液酸乳糖（6'-sialyllactose，6'-SL）、乳糖-N-新四糖（lacto-N-neotetraose，LNnT）、3-岩藻糖基乳糖（3-fucosyllactose，3-FL）等（结构式见图1）[5-8]。其中，2'-FL是含量最多的一种HMO，可占母乳中HMO含量的30%[9-12]。牛乳、山羊乳、绵羊乳中几乎不含HMO，或含量仅为母乳的百分之一甚至千分之一，且种类更少。HMO对婴幼儿的健康与发育起到关键作用，在出生后的4～6 个月内如没有摄入或仅摄入少量母乳会增加患肠胃炎、急性中耳炎及免疫系统疾病的风险，长大后容易超重或发展成为Ⅱ型糖尿病，且智力水平可能低于母乳喂养婴幼儿[13-15]。因此，牛乳（乳粉）喂养新生儿与母乳喂养新生儿会有较大差别，医学研究建议进行全母乳喂养。随着国内生活水平的不断提高，在婴幼儿乳粉配方中添加HMO，使其营养水平达到母乳水平的需求与日俱增，开发HMO的合成技术具有重要的经济价值和社会意义[16]。2005—2012年，Agoston等[17]开发了化学法合成2'-FL和LNnT的技术，然而该方法比较复杂，步骤多、原料昂贵，导致终产品价格居高不下，这对未来的规模化应用造成了极大限制。近年来，利用微生物细胞工厂生产2'-FL、3-FL、LNnT、6'-SL等HMO的研究逐渐兴起，为生物技术路线对化学工艺的全替代提供了可能。本文对2'-FL的生物合成方法研究进展进行综述，为该领域研究提供借鉴。

图 1 几种主要HMO的结构示意图Fig. 1 Chemical structures of several major HMOs

1 2'-FL的生理功能研究

20世纪初，欧洲1 岁以内非母乳喂养婴儿的死亡率高达20%，是母乳喂养的7 倍，引起科学家的广泛关注。母乳喂养与非母乳喂养婴儿粪便中的细菌组成不同，前者含有更多的益生菌，对保持健康极为有利。20世纪30年代发现寡糖是母乳中最重要的益生元，然而HMO的人工合成方法直到近年来才被掌握。HMO结构非常稳定，不受巴氏杀菌、冷冻干燥及温度变化的影响[9]。HMO在乳腺中合成，其含量与组成在不同女性中不同，在同一女性的不同哺乳阶段也有差别，哺乳早期含量更高，随着哺乳时间延长逐步降低[13]。HMO是无法被人体消化的寡糖，对婴儿双歧杆菌及其他双岐杆菌有促生作用，因此能够减少潜在有害细菌的繁殖；HMO结构与小肠上皮细胞表面的糖受体相似，能够作为诱饵与有害菌结合，从而降低其在人体定植和入侵的概率[14]。此外，婴儿双歧杆菌能够产生短链脂肪酸，帮助调节微环境，使得益生菌的生长优于致病菌[15]。肠杆菌能够诱发新生儿坏死性小肠结肠炎，但包含病原菌的肠杆菌在含有2'-FL、6'-SL、LNnT的环境下无法生长，却能够在含有低聚半乳糖（galactooligosaccharides，GOS）的环境下良好生长，表明HMO抑制病原菌的效果大大优于GOS[9]。截止目前鲜有研究表明2'-FL会对人体健康带来负面影响，因而2'-FL有很高的食品安全性，为其大规模推广应用奠定了基础[11]。

2 利用大肠杆菌生物合成2'-FL

大肠杆菌合成2'-FL的途径如图2所示，其中乳糖是所有合成途径必需的原始底物，二磷酸鸟苷（guanosine diphosphate，GDP）-L-岩藻糖则是关键中间体。仅依赖葡萄糖或甘油的2'-FL合成途径称为De novo途径，而依赖外源添加L-岩藻糖的合成途径则称为Salvage途径。

图 2 大肠杆菌合成2'-FL的途径示意图Fig. 2 Biosynthetic routes of 2'-FL inE. coli

2.1 从头合成法（De novo途径）

Albermann等[18]将大肠杆菌K12来源的GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶（Gmd酶）和GDP-L-岩藻糖合酶（WcaG酶）进行克隆与表达，结果表明，Gmd酶在N-端添加组氨酸标签后失活，而WcaG酶则不受影响。WcaG酶以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）为辅酶，Mg2＋和Ca2＋能够激活该酶活性，且WcaG酶受到产物GDP-L-岩藻糖的反馈抑制[18]。进一步将幽门螺杆菌来源的FucT2酶（岩藻糖基转移酶）通过谷胱甘肽硫转移酶（glutathione S-transferase，GST）标签融合表达并纯化，使用酶法合成的GDP-L-岩藻糖与乳糖为底物催化，成功获得产物2'-FL，证明2'-FL合成关键酶经表达纯化后能够在体外实现催化[19]。以上研究为微生物细胞工厂合成2'-FL奠定了理论基础。2006年，Drouillard等[20]利用大肠杆菌合成2'-FL，应用来源于幽门螺杆菌的futC基因，但通过14C标记的活性测定证明Thioredoxine和GST标签均无法提高FutC酶的活性，最后在大肠杆菌DE3菌株中过表达转录因子RcsA，敲除多糖可拉酸合成途径的wcaJ基因和编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因，成功获得了一株生产菌，该菌株经过45 h高密度发酵可消耗15 g/L初始乳糖并获得14 g/L的2'-FL（胞外11 g/L、胞内3 g/L）。该研究具有开创性意义，为2'-FL的生物法生产技术奠定了基础。以上合成途径均利用碳源直接合成2'-FL而没有外源添加L-岩藻糖，因此称为从头合成法（De novo途径）。

文章来源：《化学与生物工程》 网址: http://www.hxyswgc.cn/qikandaodu/2021/0222/817.html